中华人民共和国农业农村部公告 第546号
根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定，经审查，批准中国动物卫生与流行病学中心等2家单位申报的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）等2种兽药产品注册，并发布产品工艺规程、质量标准、说明书和标签。自发布之日起执行。
特此公告。
附件：1.注册目录
2.工艺规程（略）
3.质量标准（略）
4.说明书和标签
农业农村部
2022年4月8日
附件1
附件4说明书
1、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）说明书（兽用）
【兽药名称】
通用名 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）
商品名 无
英文名 African Swine Fever Virus Real–time PCR Test Kit（One–step）
汉语拼音 Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe（Yibufa）
【作用与用途】 用于全血、血清、血浆、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体和肌肉等样品中的非洲猪瘟病毒核酸的检测。
【用法与判定】
1 用法
1.1 样品处理
1.1.1 全血、血清、血浆直接进行下一步试验。淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肌肉等组织样品取0.1～0.2g，置研钵充分研磨，加入10倍体积约1～2ml生理盐水，混匀；或置研磨管中，加入10倍体积约1～2ml生理盐水及研磨珠，用组织研磨仪匀浆。以5000转/分钟离心5分钟，留上清，即为组织匀浆液。
1.1.2 取1.5ml离心管加入100μl缓冲液B1，每管分别加入10μl全血（EDTA抗凝剂）或20μl组织匀浆液、血清、血浆样品、阳性对照和阴性对照混匀。室温3分钟内涡旋混匀3～5次。
1.1.3 每管加入100μl缓冲液B2，涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为待检核酸。
1.2 扩增试剂准备 取18μl PCR反应液至PCR反应管；依次分别加入2μl阴性对照、样品和阳性对照待检核酸，盖紧管盖，每个反应管内反应体积为20μl。
1.3 将PCR反应管瞬时离心，置荧光PCR仪内，进行如下反应：
1）95℃预变性20秒；2）95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号。
2 判定
2.1 试验成立条件
阳性对照Ct值应＜35且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。
2.2 结果判定
样品Ct值≤37且出现特异性扩增曲线，判为阳性；无Ct值且无特异性扩增曲线，判为阴性；
当37＜Ct值＜40时判为可疑，应重新提取样品核酸进行检测，若Ct值仍＜40，则判为阳性，若无Ct值且无特异性扩增曲线，判为阴性。
【注意事项】 （1）使用本试剂盒的实验室应严格按照国家有关规定进行管理。
（2）PCR反应液对温度敏感容易失活，使用时应置于冰上，使用后应立即冻存，每盒反应液冻融次数不宜超过3次。
（3）缓冲液B1、B2使用前融化恢复至室温并充分摇匀，融化恢复至室温的缓冲液B1、B2可室温保存。
（4）扩增试剂准备时应按阴性对照、待检核酸、阳性对照的顺序加入PCR反应管中。
（5）吸取反应液时，应避免产生气泡；加样结束后应盖紧管盖，以免液体蒸发。
（6）处理样品用器械及废弃物品应高压灭菌。检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有10% 84消毒液的带盖废物缸内。检测结束的PCR反应管，严禁开盖不得高压处理。
（7）工作台及各种实验用品应定期清洁并用10% 84消毒液或紫外灯进行防污染处理。
（8）各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁。
（9）严禁使用超过有效期限的试剂；不同批号的试剂请勿混用。
【规格】 （1）10检份/盒 （2）25检份/盒 （3）50检份/盒 （4）100检份/盒
【贮藏与有效期】 -20℃以下冷冻保存，有效期12个月。
2、非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒说明书（兽用）
【兽药名称】
通用名 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒
商品名 无
英文名 African Swine Fever Virus Real–time PCR Detection Kit
汉语拼音 Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe
【作用与用途】 用于全血、血清、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肺脏、肌肉、血粉、环境样品等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。
【用法与判定】
1 用法
1.1 样品采集及处理
1.1.1 活猪样品 无菌采集抗凝血或血清5ml。2～8℃低温运至实验室用于检测。
1.1.2 病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品 无菌采集死猪的脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。
1.1.3 病猪污染的周边环境 采集与病猪相关场所的粪便、污水样品。2～8℃低温运至实验室用于检测。
1.2 样品处理方法
1.2.1 全血、血清样品处理方法 直接取200μl全血、血清进行核酸提取。
1.2.2 淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肺脏、肌肉等组织样品处理方法 取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，震荡研磨，制成约10%的组织匀浆液，5000转/分钟离心5分钟，取200μl上清液进行核酸提取。
1.2.3 粪便、血粉样品处理方法 取适量的粪便、血粉放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，震荡研磨，制成约10%的匀浆液，5000转/分钟离心5分钟，取200μl上清液进行核酸提取。
1.2.4 污水样品处理方法 摇匀后，取200μl污水进行核酸提取。
1.3 样品核酸提取 采用DNA提取试剂盒或自动核酸提取仪提取各类样品中的核酸。低温保存待检。
1.4 PCR扩增 将试剂盒置室温使荧光PCR预混液、阴性对照和阳性对照完全融解，并混匀。取18μl荧光PCR预混液至每个反应管内，然后加2μl所提取的样品核酸，每个反应总体积为20μl。每次检测应设立阳性对照和阴性对照。在荧光PCR仪上进行扩增检测。
1.5 反应程序 50°C孵育2分钟，95°C预变性5分钟；95°C变性15秒，60°C退火延伸1分钟，45个循环，在每一循环的60°C时收集FAM荧光信号。
2 判定
2.1 阳性对照Ct值应＜30且出现特异性扩增曲线，阴性对照应无Ct值或Ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。
2.2 被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，判为阳性；当无Ct值或Ct值≥40，判为阴性；当38＜Ct值＜40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，模板量加倍（4µl）进行复检2次，有1次出现Ct值＜40且出现特异性扩增曲线即判为阳性，否则判为阴性。
【注意事项】 （1）PCR检测的每一步都应在专门区域或地点进行。
（2）使用前应将荧光PCR预混液、阴性对照和阳性对照完全融化，充分振荡混匀，瞬时离心，尽量吸取液体上层。
（3）试剂盒不同组分间不得交叉，防止污染。
（4）避免反复冻融。
（5）PCR产物均应合理处理，以免造成污染。
（6）严格按照使用说明书进行操作。
（7）按要求贮藏，冷链运输；并在有效期内使用。
【规格】 50次/盒
【贮藏与有效期】 -20℃以下保存，有效期为12个月。
来源：农业农村部
