口蹄疫病毒改造及反向疫苗研究

一、口蹄疫病毒改造的技术需求

2012年，世界粮农组织和世界动物卫生组织（FAO/OIE）联合要求各成员国采取逐步控制路径（progressivecontrol pathway-FMD，PCP-FMD）进行全球口蹄疫控制，通过病原监测和免疫预防来控制疫情，逐步到免疫无疫，最终实现无疫认定。2012年5月，国务院发布《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》，明确将口蹄疫列为优先防控的疫病，将疫苗免疫作为防控和净化的核心技术手段。

通过提高畜群整体的免疫水平，可有效降低疾病的流行水平和范围，结合鉴别疫苗免疫和野毒感染以及净化技术手段，进而实现国家疫病净化和根除的目标。然而，由于口蹄疫病毒生物学自然属性的原因，口蹄疫病毒具有强致病性导致疫苗生产存在巨大生物安全隐患；口蹄疫病毒具有免疫抑制特性、抗原不稳定、抗原性差、免疫应答晚和免疫持续期短等缺陷，制约常规疫苗的效力提升，严重影响疫苗的田间应用效果。而目前疫苗难以鉴别免疫动物和自然感染动物，也给疫情净化带来困扰。如何从疫苗的“源头”种毒上解决上述问题，具体技术需求分析如下：

1. 种毒自然属性的缺陷是限制常规疫苗技术生产高效疫苗的瓶颈问题
   动物疫苗制品关键技术涉及疫苗毒种、抗原生产工艺、浓缩纯化、佐剂以及生产过程中的质量控制等，其中疫苗种毒是决定疫苗研制是否成功的核心技术环节。世界动物卫生组织通行的常规疫苗种毒筛选的技术要求：一是抗原匹配性好，可对当前流行毒株有效保护；二是免疫原性强，可诱导动物产生足够强的免疫应答反应，产生坚强的免疫力；三是生产性能好，疫苗候选毒株具有病变时间短、滴度高和病变稳定等较好的生产性能，可用于工业化生产。从流行毒株筛选疫苗种毒是最常见和最能快速见效的一种方法，直接解决了抗原匹配性的要求，但对另外两个要求，仍然要试验来证明。而现实情况是因为流行毒株生物学自然属性的原因，导致生产性能或免疫原性往往不符合要求，前功尽弃。
2. 常规疫苗效力不高，影响疫苗田间免疫效果
   通过提高疫苗免疫效力，建立坚强的免疫力，可以有效阻断疫情蔓延和变异，也可以有效防止境外毒株传入。保证免疫控制效果的核心是疫苗效力。免疫不足和效力不强，不仅不能限制病毒传播，反而会加速其变异。口蹄疫田间防控效果不好，有以下原因：（1）口蹄疫病毒能够抑制宿主免疫，形成免疫逃避，导致流行毒株难防控。（2）目前使用的疫苗是灭活疫苗，含有抑制宿主免疫的蛋白，不能产生很好的细胞免疫。而且抗原容易降解，抗原分解为五聚体亚基，2～8℃冷链运输和保存，仍然有较快的降解速度，导致疫苗免疫原有效成分降低。疫苗抗体产生慢，免疫持续期短（一般4～6月），容易有免疫空白期，这导致疫苗田间的免疫效果有限，不能有效控制和阻止毒株循环蔓延。（3）口蹄疫毒株有多个拓扑型和谱系，疫苗种毒的抗原谱与流行毒株不匹配。
3. 疫苗生产种毒为强毒株，存在巨大的生物安全隐患
   常规疫苗生产通过扩繁大量的强毒株生产抗原，这些毒株对宿主具有很强的毒力和致病性，大量病毒的生产和储藏很容易造成散毒事件，带来很大的生物安全威胁。如2007年的英国、1970—1980欧洲和1977—1994年阿根廷暴发的口蹄疫都属于散毒事件。尽管通过提高硬件设施级别和加强规范管理可以降低散毒和生物安全性风险，但这种隐患仍然没有解除。要想从根本上消除疫苗生产的生物安全威胁，必须对疫苗毒株进行改造，从种毒“源头”解决生物安全隐患问题。
4. 疫苗免疫无法区分自然感染和免疫动物，没有净化根除的技术支撑
   常规灭活疫苗很难实现感染动物与免疫动物的鉴别诊断，给疫病净化带来困难。多次免疫的动物，特别是反复免疫的种畜，都能产生非结构蛋白抗体。反刍动物（包括免疫的反刍动物）发生口蹄疫或者被感染都会形成带毒（持续感染）。目前的鉴别诊断和常规疫苗很难支撑实施口蹄疫净化政策。因此，需要在疫苗种毒上进行改造，研究标记疫苗等新型疫苗，从而在疫苗株上彻底解决上述问题的困扰。

二、口蹄疫病毒的反向疫苗研究进展

反向疫苗学在口蹄疫病毒中的应用为解决上述问题提供了可能，通过反向遗传技术实现对病毒基因的改造和修饰，可获得预期生物特性的毒株，以及提高生产性能、抗原匹配性、免疫应答能力和生物安全性等特征的疫苗种毒，并与周边或其他国家流行而中国未流行的毒株迅速配型，也可以尽量减少和避免流行毒株驯化环节带来负面影响,这种技术制备的疫苗称之为反向疫苗。这种技术不仅改变了疫苗毒筛选驯化技术受病毒自然属性制约大、费时费力、成功率低的缺陷，可以实现更为主动有效的疫苗毒株构造和改良，实现了口蹄疫灭活疫苗毒种制备工艺的革新，对整体提升疫苗品质和效力具有重大意义。

(一）提高生产性能
流行毒株驯化成疫苗株需要满足许多条件，并不是每个流行毒株都能够驯化成疫苗株，有许多流行毒株不能够驯化成疫苗株，一个重要的原因是毒株效价低，不能满足疫苗生产性能要求。Rodriguez等的研究发现O型口蹄疫病毒的复制与病毒RNA 3'端非编码区（3'UTR）的茎环结构有关。经实验显示也发现多株3'UTR颈环突变株，为了验证SL结构的突变在口蹄疫病毒中发挥的作用，在O/CHA/99毒株中引入SL突变并构建了相关的重组毒株，结果发现SL1突变的重组毒株在BHK细胞中生长缓慢，表明SL1结构对病毒的复制有重要的作用。2009年发生A型口蹄疫，其毒株A/WH/09在BHK细胞上复制效果不理想，滴度低，不能满足作为疫苗候选株。因此实验室选取SL结构并没有突变的O/CHA/09感染性全长cDNA作为骨架构建重组质粒rA/P1-口蹄疫病毒。研究表明重组质粒转染细胞后得到的病毒在BHK细胞中生长特性与O/CHA/99相似，而且也缩短了重组毒株在细胞中的病变时间，更重要的是重组病毒在BHK细胞的病毒滴度与流行毒A/WH/09相比有明显的提高，通过替换P1基因，获得了与流行毒株有很好的抗原匹配性。测序比较第5代到30代之间的重组毒株序列，结果显示它们具有很高的同源性，而且几乎没有氨基酸差异，表明该重组毒株具有稳定的遗传特性。该研究为提高疫苗生产性能具有重要作用。

（二）提高抗原匹配性

1. 抗原匹配性是保障疫苗效力的一个最为重要的技术指标。P1是口蹄疫病毒的结构基因，含有1A、1B、1C和1D4个基因，并分别编码VP4、VP2、VP3和VP1四种结构蛋白，口蹄疫不同血清型也是通过比较P1序列的差异来定型的。由于口蹄疫南非型病毒在不同地域具有明显的遗传和广泛的抗原变异性，因此对于口蹄疫疫苗的应用是比较困难的。BelindaBlignaut等通过在SAT1型病毒株KNP/196/91的感染性cDNA克隆中编码外部衣壳蛋白的区域（1B-1D/2A）替换SAT2型疫苗株ZIM/7/83相应位点，构建了型交叉的嵌合病毒vKNP/SAT2。该嵌合的病毒vKNP/SAT与亲本毒株KNP/196/91相比具有相似的感染性动力学、病毒粒子的稳定性和抗原性，表明了各型之间衣壳具有的功能是比较容易替换的，并获得了稳定而且具有高滴度嵌合病毒。将亲本毒和嵌合毒制备的疫苗分别接种豚鼠后诱导产生相似的抗体反应，之后又用该嵌合病毒接种猪后也能够产生中和抗体并能抵抗同源口蹄疫病毒的侵袭。2013年，实验室利用反向遗传技术将流行毒株A/WH/09的P1基因替换疫苗株O/CHA/99相应片段后构建的重组毒株rA/P1-口蹄疫病毒表现为一步生长曲线与O/CHA/99相似，而且它的滴度比流行毒株A/WH/09要高。将该灭活的毒株免疫接种牛后大多数在第7天产生体液免疫，并且使用2μg免疫接种28d后感染A/WH/09毒株，实验动物能够得到全保护。
2. 口蹄疫病毒的结构蛋白VP1是决定病毒抗原性的主要成分，其中VP1的141～160位和200～213位的氨基酸残基区是口蹄疫病毒的主要抗原区，这些位点不仅能够诱导动物产生中和抗体，也是决定病毒抗原性的高变区。通过对口蹄疫型与型及亚型间VP1的研究，对口蹄疫流行病学的研究以及新型疫苗的研制都是很重要的。2008年Fowler等将O1BFS和C3RES的VP1 G-H的130～157位点替换A12毒株相应区域，并制备了单价的标记疫苗，结果显示该嵌合病毒制备的灭活苗能够对牛产生完全保护，免疫猪后发现有同样的效果，并在免疫后21d仍可完全保护动物免受口蹄疫病毒的攻击。2012年，李平花等以O/HN/93疫苗毒株的感染性克隆为骨架，用新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因（主要是VP1蛋白上的B-C环和G-H环）替换疫苗毒株的相应部分，构建了嵌合的口蹄疫病毒全长cDNA克隆。该嵌合病毒的成功拯救为口蹄疫嵌合疫苗的研制奠定了基础。

（三）改善抗原稳定性

1. 热稳定性疫苗 目前有很多因素影响着口蹄疫疫苗的效力，其中一个因素是疫苗的不耐热性，中温就可导致疫苗分解为五聚体亚基，使疫苗免疫原性的丧失。因此，疫苗生产工艺中昂贵的冷链条件是必须的，但是气候和社会经济因素通常会影响冷链系统。基于此，科学家通过反向遗传操作技术试图改造有感染性并具有耐热性的口蹄疫疫苗，在不改变当前使用生产程序的条件下降低对冷链的需求。2008年，Roberto Mateo等通过反向遗传技术改造的口蹄疫病毒粒子在不破坏感染性所需生物学功能的前提下，提高了病毒粒子抵抗热分解为五聚体亚基的稳定性。将位于衣壳亚基间对感染性非必须的氨基酸用其他氨基酸替换有利于在亚基间形成新的二硫键或静电相互作用力，实验室获得的两株重组毒（A2065H或D3069E/T2188A）不仅具有感染性，遗传稳定性，而且与亲本毒相比具有相似的抗原性，更重要的是重组毒提高了病毒不可逆分解的稳定性，这为当前生产口蹄疫疫苗减少了冷链的依赖。2013年，Claudine Porta等将口蹄疫病毒空衣壳上位于毗邻正二十面体二重对称轴93位的组氨酸突变为半胱氨酸（H2093C），以便在五聚体间有利于形成二硫键。通过热处理表明该重组衣壳提高了热稳定性，且通过X-射线晶体衍射证明重组与野生型的空衣壳具有和完整病毒基本一样的结构。用重组衣壳接种牛后具有持续性病毒中和抗体的存在，且在免疫后34周获得保护。这种疫苗抗原生产即降低生产成本，减少感染的风险并提高产物的热稳定性。
2. 酸稳定疫苗 口蹄疫病毒微粒在稍低于中和pH的条件下会分解从而失去感染性。这种酸依赖的分解过程会导致病毒RNA在胞体中的释放。为了研究病毒对酸诱导分解作用的分子机理，MiguelA. Martín-Acebes等获得了六株能够增强对酸失活的突变株，并将这些突变株转染细胞后发现它们与亲本毒C-S8c1相比对提高胞内pH的药物更敏感，证实了提高耐酸性与低pH时病毒的脱衣壳有关。并且在六株突变株中都发现了病毒VP1衣壳蛋白N端17位的N替换为D，这些突变株能够抵抗酸诱导失活的原因是阻止了衣壳分解为五聚体的亚单位。有意思的是，N突变为D的位点靠近五聚体的接口处，这些突变株表明了口蹄疫病毒突变株不同的pH敏感性，并阐明了病毒准种对pH的变化具有适当的灵活性。

(四）提高免疫应答能力
提高机体的免疫应答能力对宿主抵抗病毒的侵袭具有至关重要的作用。口蹄疫病毒的前导蛋白（Lpro）是一种木瓜蛋白酶，它不仅能将自身从多聚蛋白上切割下来，还能裂解宿主细胞的翻译起始因子eIF4G从而关闭宿主mRNA帽依赖性翻译，最终导致干扰素蛋白表达水平下降；Lpro作为去泛素化蛋白酶，通过抑制RIG-I、TBKI、TRAF6和TRAF3的泛素化，从而抑制I型干扰素信号的传导。因此口蹄疫病毒的L蛋白是能抑制机体天然免疫的重要蛋白，通过对L蛋白的缺失或突变将会激发机体的天然免疫，从而抵抗口蹄疫病毒的侵袭。Fayna Diaz-San Segundo等利用反向遗传技术构建的SAP突变株就能够激活宿主的天然免疫，进而表现为重组毒对猪和牛没有临床症状，并且能够保护动物机体免受口蹄疫病毒的入侵。RodriguezPulido M等利用反向遗传技术构建的RNA疫苗株免疫猪后产生特异性体液和细胞免疫反应，提高了机体的免疫应答能力。

（五）提高生物安全性

1. 减毒或弱毒活疫苗株 减毒或弱毒活疫苗株是指利用反向遗传技术敲除病毒的一些位点或核苷酸等致病基因，使其失去对宿主的致病力，但仍保留免疫原性及复制能力。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序是口蹄疫病毒细胞吸附相关位点，Mckenna等在A12株感染性分子克隆的基础上拯救出了缺失RGD受体结合基序的重组口蹄疫病毒，用其免疫牛后能够免受强毒的攻击。2010年Fowler等构建了缺失VP1 G-H 13个氨基酸和RGD受体结合位点的重组毒，并发现该重组毒免疫牛以后可以免受亲本毒的侵袭。1995年Piccone等构建了缺失L蛋白的A12-LLV2病毒，之后证实了这株病毒对牛和猪都具有致弱的作用，可以作为口蹄疫病毒的致弱疫苗。2012年，Sabena Uddowla等通过在缺失Lpro A24LL株的基础上拯救出了安全有效的标记疫苗，研究表明该毒株可以作为一种安全的减毒疫苗候选株，并且可以作为标记疫苗来区分感染与免疫的动物。
2. 对宿主无致病性株 SAP是Lpro中一段假定的区域，Lpro可通过SAP结构作用抑制NF-κB的活性以及下调IRF3/7的表达来抑制IFN-β的转录进而影响宿主的天然免疫。2011年，Fayna Diaz-San Segundo等利用反向遗传技术构建的SAP突变株表现对BHK-21细胞较高的滴度，而对猪没有临床症状、无血毒症和无排毒等现象。而且SAP突变株接种动物引起较强的中和抗体反应，并能够产生早期免疫的全保护，具有发展为无致病疫苗株的潜力。在此基础上，实验室通过改变受体结合位点（RGD突变为RSD），制备出Asia1-SAP-RSD的毒株不仅对猪牛没有表现出临床症状、无血毒症和无排毒现象，而且在BHK细胞以及乳鼠中都具有很高的滴定（约10-8），并在接种48小时后就能够产生早期免疫的全保护，产生较早的抗体应答和免疫保护，具有发展为疫苗毒株的潜力。

(六）区分自然感染和免疫的标记疫苗株
对于RNA病毒作为表达载体主要的障碍就是它们固有的遗传不稳定性，尤其是病毒在细胞培养时在复制期间表达的较大外源蛋白容易部分或全部丢失。这种倾向可以简单的解释为插入外源序列后对病毒复制效率的有害作用。目前将口蹄疫病毒作为载体的研究不是很多，因为在口蹄疫病毒基因组上鉴定出的可插入外源基因的位点后能拯救出活病毒是比较困难的。近年的研究发现口蹄疫病毒的L蛋白、3A蛋白、3B蛋白以及VP1蛋白处可以插入外源基因或表位标签，从而为标记疫苗方面的应用提供有效的平台。利用反向遗传技术插入外源标签不仅在研究病毒致病机制有重要的作用，而且对标记疫苗的制备也是相当重要的。我们将从以下插入位点对口蹄疫病毒标记疫苗作以详细的描述。

1. L蛋白 L蛋白通过调控宿主的天然免疫反应在口蹄疫病毒毒力方面有着重要的作用。口蹄疫病毒的前导蛋白L有两种形式Lab和Lb，它们的起始密码子AUG相距84nt，这两个AUG密码子在口蹄疫病毒的所有七个型中都存在。较小的Lb蛋白由第二个功能性的AUG起始合成，而相对Lab，尽管Lb在下游，但在体外翻译和感染细胞中的合成要过量。之前的研究显示每个起始位点依赖于它们周围的核苷酸序列以及起始AUG上下游的RNA结构。此外，Cao等已经验证了第二个AUG起始位点对口蹄疫病毒的复制有重要的作用，现在还不清楚的是在口蹄疫病毒的感染过程中为什么需要合成两种形式的L蛋白。特别要指出的是L蛋白中最易发生变化的区间是两个AUG之间的区域。Piccone等研究表明AUG之间的区域可以插入57个nt，利用反向遗传技术获得的重组毒株pA24-L1123在细胞中的复制水平比野毒稍低些，而且对牛的致病性有明显的减弱。在此基础上Piccone又引入了两个表位标签（HA和Flag）和一段较小的tc基序。HA和Flag标签都有利于免疫反应试验，而tc基序在活细胞中观察动力学过程中也是很有用的。是不是L蛋白的两种形式都在病毒的复制和发病机制中发挥重要作用，目前还不是很清楚。因为Lab和Lb仅仅是氨基末端不同，多克隆抗L蛋白的抗血清不能够区分它俩。而且，两AUG之间区域的疏水性使它很难产生特异性抗体。因此，在这个区域引入标签（HA，Flag或tc）就显得非常重要了。在L蛋白上的标记不仅可以研究L蛋白在病毒翻译和复制中的功能性作用，而且还可以作为标记疫苗的标记位点。
2. 3A蛋白 3A蛋白具有膜相关性，它被认为是微RNA病毒复制复合体与膜结构结合的锚定蛋白，并与病毒诱导的细胞病理效应和阻断宿主细胞内蛋白的分泌有关。通过对不同口蹄疫病毒分离株3A蛋白的遗传比较显示编码N端亲水性的3A区域的前半部分是高度保守的，而后半部分区域（C端区域）是可变区并且天然存在不同位置的缺失（包括85～102，93～102和133～143残基处的缺失）。3A蛋白93～102位的缺失使病毒对牛的致病性弱化而对猪保持较高致病性。此外，研究表明表达全长3A蛋白的口蹄疫病毒可以允许93～102位氨基酸的缺失而不影响病毒在体外复制的能力。表明3A蛋白的85～102和133～143位点对于口蹄疫病毒的复制是非必须的区域，并且是操纵插入外源表位合适的靶位点，如同O/HN/CHA/93株的缺失发生在3A蛋白93～102aa位点处。Li等选用3A蛋白的两个位点（85～92和133～143）分别作为不同外源标签的插入位点来研究口蹄疫病毒表达表位标签的能力。使用一段8个氨基酸的FLAG表位和11个氨基酸的HSV表位来分别替换3A蛋白原有的85～92和133～143的氨基酸序列，这并没有增长基因组的长度。利用反向遗传操作技术将FLAG和HSV标签分别引入到3A蛋白的85～92和133～143的位点，然后将构建的质粒转染到BSR/T7细胞系中拯救出了病毒，表明口蹄疫病毒3A蛋白允许外源表位引入到C端并维持口蹄疫病毒的复制功能。通过蛋白免疫印迹和序列分析表明3A蛋白标记的病毒在BHK-21细胞上连续传11代后仍可稳定表达外源表位，噬斑和生长曲线结果表明重组毒和亲本毒具有相似性。将重组毒感染Kunming小鼠四周后，发现接种标记3A蛋白病毒的小鼠能够诱导抗标签和抗3ABC抗体的产生，而感染亲本毒的另外些小鼠仅仅产生了抗3ABC抗体。血清学结果显示3A标记的病毒能诱导特异性抗体应答反应以区分亲本毒产生的抗体应答。因此，3A标记的病毒可以作为允许在血清学水平上区分免疫接种与天然感染动物的市场化疫苗。
3. 3B蛋白 3B蛋白是共价结合在病毒基因组5′端并具有引发微RNA病毒合的功能。口蹄疫病毒的3B蛋白不同与其他微RNA病毒，它具有三个相似但不相同的拷贝3B1（VPg1）、3B2（VPg2）、3B3（VPg3），分别由23,34,24个氨基酸组成，并且它们在基因组中呈串联式排列。虽然口蹄疫病毒3B的三个拷贝对维持病毒感染性不都是必须的，而且也没有报道过田间的口蹄疫病毒毒株有少于三个拷贝，表明了口蹄疫病毒在维持这种冗余方面具有很强的选择压力。这是一个不寻常的发现，因为口蹄疫病毒很容易通过同源重组去除冗余的基因。研究表明对3B蛋白拷贝数的部分缺失或插入外源基因序列可以拯救到活的病毒。仅编码VPg3的口蹄疫病毒对细胞具有感染性，表明VPg的一种拷贝可能足以完成病毒复制的循环。仅编码VPg1或VPg2的口蹄疫病毒而缺失VPg3蛋白是拯救不到病毒的，表明了VPg3对口蹄疫病毒的感染性是重要的。2010年Armando Arias等构建了仅编码一种VPg的四种口蹄疫病毒重组毒：VPg1、VPg3以及两种包含部分VPg1和VPg3的嵌合型，结果显示除仅表达VPg1以外都可以拯救到病毒。2010年Pacheco J M等构建了在3B中插入或缺失的口蹄疫病毒感染性全长cDNA，三株在不同拷贝的3B蛋白中分别随意插入19个氨基酸，另外又构建了两株3B蛋白的部分缺失。实验表明五株重组毒与亲本毒具有相似的生长特性，相似的病毒复制动力曲线以及相似的噬斑形态。此外，将五株重组毒通过气溶胶感染方式接种牛，出现了与亲本毒相似的临床症状，表明在不同拷贝的3B蛋白中引入突变后体内外不会对病毒产生显著的影响。2012年，Sabena Uddowla等通过在3B基因中氨基酸的突变拯救出了安全有效的标记疫苗。综上所述，口蹄疫病毒的3B基因可以插入外源基因，并可作为标记疫苗的插入位点。
4. 3D蛋白 3D蛋白是口蹄疫的非结构蛋白，高度保守的口蹄疫病毒 3D聚合酶（3Dpol）长期被认为是感染口蹄疫的主要决定因素并曾今成为口蹄疫病毒感染相关抗原。Newman和Brown的研究表明口蹄疫病毒纯化的140S颗粒含有少量的3Dpol，这是由于注射多剂量的灭活FMD疫苗产生的。2012年，Sabena Uddowla等构建的含有一个或二个部位的突变在3D聚合酶（3DPOl）和3B非结构蛋白中形成阴性抗原标记，在3Dpol H27Y、N31R和3BRQKP9-12→PVKV替代的突变株中止了单克隆抗体靶向3Dpol和3B的反应。比较亲本的A24WT病毒、突变株A24LL3DYR和A24LL3BPVKV3DYR通过自然气溶胶或直接舌部注射接种牛后被标记毒力减弱。而且用A24LL3DYR活病毒在蹄球部接种猪表现没有临床症状，间接接触的动物不会传播FMD。用化学方法灭活A24LL3D和A24LL3BPVKV3DYR疫苗免疫的牛100%保护亲本毒的感染。这些减弱的抗原标记病毒提供了一种安全并改变FMD疫苗毒力株的生产。同时，一种竞争酶联免疫吸附实验靶定阴性标记提供了一种适合同时区分感染和免疫的动物。
5. VP1蛋白 VP1是口蹄疫病毒（口蹄疫病毒）结构蛋白，并且是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白。为了在口蹄疫病毒衣壳蛋白上寻找插入或替换位点，科学家们想到了各种衣壳蛋白表面暴露的区域。考虑到超变区G-H环的灵活性，Paul Lawrence等在病毒衣壳上的RGD基序的上游序列插入了外源标签。选择FLAG标签是为了区分野生型（WT）蛋白与重组的蛋白。他们设计并产生了在VP1 G-H环 RGD上游嵌入FLAG标签的重组口蹄疫病毒。实验使用的野毒是以A24株为骨架，FLAG的八肽（DYKDDDDK）替换了G-H环保守RGD基序上游的八个氨基酸（SKYAVGGS）。并且为了使替换的FLAG序列对病毒产生的破坏最小化，他们将FLAG表位中的YK氨基酸用KY氨基酸替换，因为KY氨基酸是A24株 G-H环上原有的氨基酸序列。结果显示插入FLAG标签后的重组毒（A24-FLAG）与野毒具有相似的复制水平，并且嵌入的FLAG标签可以使用抗FLAG抗体检测。因此可以通过多重免疫学试验区分A24-FLAG毒株。而且，通过检测A24-FLAG免疫牛以后的临床样品，可以发现免疫后FLAG表位依然存在。2013年Julian Seago等利用反向遗传技术在VP1与2A之间构建了表达荧光标记蛋白iLOV的重组口蹄疫病毒。对感染性重组iLOV-FMDV生物学特性分析表明重组毒与亲本毒具有相似的生长特性，此外，通过流式细胞术可以很容易将感染重组毒iLOV-FMDV的细胞与正常细胞区分。重组毒iLOV-FMDV的成功拯救为研究口蹄疫病毒的体外感染提供了一种依据。

(七）核酸疫苗
天然免疫反应是抵御入侵病原体的第一道防线，并依赖于一些传感器及信号通路。病毒产物作为病原体相关模式分子（PAMPs）起始的信号级联反应引起I型干扰素的分泌的抗病毒反应。在病毒的感染过程中（包括单链RNA和双链RNA）出现病原体相关模式分子，在感染的细胞中产生了以基因片段、复制中间体或茎环结构的dsRNA，并由病毒传感器识别。信号级联放大反应阻止病毒的复制和传播。口蹄疫病毒对干扰素（IFN）是高度灵敏的，2011年Miguel Rodríguez Pulido等研究表明口蹄疫病毒基因组的5′端和3′端非编码区在猪肾细胞和幼鼠中能够引发IFN-α/β的反应，在体外产生的RNAs，能刺激IFN-β的转录并在SK-6细胞中诱导产生抗病毒反应，表明病毒RNA能够激发机体的天然免疫反应。2009年，Miguel Rodríguez Pulido等利用反向遗传技术来研发RNA疫苗，SL1和SL2是口蹄疫病毒 RNA3撇端非编码区的的两个茎环结构，作者以O1K感染性克隆为基础构建了SL1、SL2分别缺失的毒株，结果表明SL2的缺失对病毒在细胞中的感染性是致命的，而SL1的缺失的病毒复制水平降低，在细胞上生长缓慢，具有减弱病毒毒力的作用。他们将构建的缺失SL1的全长质粒（VP3 56位的Arg突变为His）在体外转录为RNA后，接种猪体内，可以诱导猪产生特异性免疫反应，包括了体液免疫和细胞免疫反应，该实验说明了可以利用口蹄疫病毒反向遗传学技术来研发 口蹄疫病毒RNA疫苗的潜力。2010年MiguelRodríguez Pulido等的研究表明RNA的免疫可以保护鼠抵抗口蹄疫病毒的感染。实验室利用单质粒拯救系统，对抑制天然免疫基因进行突变、对感染路径RGD进行缺失，获得了DNA质粒免疫猪，能够产生于灭活疫苗相当保护率的疫苗，是很有潜力的DNA疫苗。

传统的灭活疫苗在口蹄疫的防控中发挥了重要的作用，但存在诸多问题，反向遗传技术提供了解决这些问题的办法，对口蹄疫新型疫苗的研制和高效疫苗研制有重要的指导和推进作用。随着反向疫苗的逐步实现产业化，将为口蹄疫防控提供重要技术支撑。但应该清醒认识到病毒基因改造可能带来的一定生物安全风险问题，应在病毒改造的源头避免毒力返强，在改造方案设计的时候，就避免生物安全风险问题，才能保证反向疫苗健康与良性发展。